Panoramica sul western blot

Il Western blot è la tecnica che permette di identificare le proteine di interesse in un campione, utilizzando l'elettroforesi su gel per separare le proteine totali presenti nel campione. Questa tecnica ha aperto la strada alla scienza biomedica, fornendo un approccio estremamente accurato al rilevamento delle proteine. Il western blotting è stato uno strumento fondamentale nella rilevazione dei segni clinici della malattia di Lyme e dell'HIV.

In questa sezione analizzeremo i fondamenti del western blotting, fornendo una panoramica delle attrezzature e delle tecniche per eseguire un blot di successo. In questa prima parte, ti presenteremo il processo di elettroforesi ed individueremo i sistemi di trasferimento e soluzioni tampone ideali per te.

Cos'è il western blot?

Il Western blot è un processo che permette di rilevare la presenza di proteine specifiche in una complessa miscela proteica estratta da cellule o tessuti. Questa procedura biomedica risale al 1979 ed è ora lo standard del settore per l'analisi delle proteine. Il Western blot è stato utilizzato per giungere a scoperte rivoluzionarie, analizzando la malattia di Lyme e l'encefalopatia spongiforme bovina (BSE) e le complicazioni che coinvolgono l'assorbimento dei nutrienti.

Ci sono tre fasi principali nel workflow del western blotting: separazione per dimensione, trasferimento su un supporto stabile e visualizzazione mediante anticorpi appropriati.

In poche parole, il western blotting è il processo utilizzato per identificare le proteine ​​attraverso la separazione elettroforetica. Questo viene fatto trasferendo le proteine da un gel su una membrana dove le proteine di interesse possono essere rilevate con precisione.

La membrana viene trattata con anticorpi primari, legando gli epitopi alla proteina bersaglio. Dopo un trattamento con un anticorpo secondario, le proteine target nel campione possono essere visualizzate utilizzando tecniche di rilevamento come il metodo della chemiluminescenza potenziata (ECL).

È un processo piuttosto lungo, che richiede più fasi di incubazione e lavaggio. Tuttavia, con una comprensione approfondita, è possibile risparmiare tempo, reagenti e campioni, utilizzando una tecnica adeguata.

Separazione elettroforetica delle proteine

L'elettroforesi è un processo di separazione delle particelle presenti all'interno di un substrato formato da gel, eseguito influenzando la carica delle particelle con un campo elettrico. Questo è un processo comune utilizzato da biochimici e biologi molecolari per rilevare e isolare la presenza di una specifica proteina in un campione costituito da una miscela complessa.

L'elettroforesi è una tecnica utilizzata per separare le proteine mediante carica. Può essere utilizzato per studiare la composizione di miscele proteiche complesse o per verificare la purezza di campioni proteici. La separazione per elettroforesi può anche servire a purificare le proteine per l'uso in ulteriori applicazioni.

Ad esempio, l'elettroforesi su gel può essere utilizzata per la separazione di nanoparticelle e più specificamente di macromolecole (DNA, RNA, proteine). Il gel viene utilizzato come mezzo anticonvettivo o setacciante durante l'elettroforesi, il che rende più facile isolare e analizzare le macromolecole in base alle loro dimensioni.

Ci sono alcune variabili da considerare quando si imposta una separazione elettroforetica. A seconda della composizione del campione e delle aplicazioni a valle per cui verrà utilizzato il campione purificato, è importante individuare i parametri corretti per eseguire una separazione ottimale. Variabili come la dimensione dei pori, la carica proteica e la forma determinano il tasso di migrazione della proteina.

Nell'elettroforesi su gel di poliacrilammide, le proteine migrano in risposta a un campo elettrico attraverso i pori in una matrice di gel di poliacrilammide; la dimensione dei pori diminuisce con l'aumentare della concentrazione di acrilammide. L'elettroforesi su gel offre diversi vantaggi, poiché il gel si versa facilmente e non denatura il campione. Inoltre, se gestito correttamente, un campione può essere recuperato dopo la corsa. Tuttavia, se parte del gel si scioglie durante l'elettroforesi, la capacità tamponante del buffer può esaurirsi, causando la corsa delle proteine presenti nel campione in forme imprevedibili.

Trasferimento delle proteine su una membrana

Il passo successivo nel western blot, dopo l'elettroforesi, è il trasferimento delle proteine. Le proteine verranno spostate da una matrice di gel a un supporto costituito da una membrana sintetica dove si legano, formando appunto il "blot". Questo viene comunemente eseguito tramite trasferimento elettroforetico.

La membrana e il gel vengono posti insieme, con una barriera di carta da filtro posta tra i due supporti e gli elettrodi. La tensione viene quindi applicata tra gli elettrodi, inducendo le proteine ​​a migrare verso la membrana seguendo la corrente elettrica.

La velocità di eluizione delle proteine dal gel è determinata dall'intensità del campo elettrico (misurato in V/cm). Le condizioni di trasferimento dipendono dal peso molecolare delle proteine bersaglio e devono essere valutate attentamente per non sotto- o sovra-trasferire un campione. In base alle tue esigenze, sono disponibili diverse opzioni per i sistemi di trasferimento.

Sistemi di trasferimento Tank Transfer

Il Tank transfer è il metodo più comune, poiché offre la più ampia gamma di possibilità di impostazioni sia per il voltaggio sia per i tempi di trasferimento (30 minuti - overnight) e sistemi di raffreddamento integrati. Queste caratteristiche rendono possibile la gestione di un'ampia gamma di proteine con dimensioni molecolari differenti. In questo sistema il gel e  le membrane sono completamente immersi, richiedendo 1-12L di tampone e un assemblaggio manuale.

Sistemi Semi-Dry

Nei sistemi semi-dry, gel e membrane sono posti tra due strati di carta da filtro bagnata con il tampone e che è posta a diretto contatto con degli elettrodi piatti. Leggermente più facili da configurare rispetto ai sistemi a serbatoio (Tank system), richiedono un lavoro minore per l'assemblaggio manuale. A causa della mancanza di opzioni di raffreddamento, ci sono alcune limitazioni sui voltaggi e i tempi di trasferimento (15-60 minuti). Questi sistemi sono ideali per molecole nell'intervallo 30-120 kD e richiedono solo 250 ml di soluzione tampone per blot.

Sistemi di trasferimento rapido 

I sistemi di trasferimento rapido sono la tecnologia più recente sul mercato che offre i tempi di trasferimento più rapidi (3-10 minuti). Simile al tradizionale sistema semi-dry, i sistemi a trasferimento rapido utilizzano carte da filtro e membrane pre-bagnate preparate in imballaggi monouso.

Ciò semplifica l'assemblaggio del pacchetto di trasferimento e richiede una configurazione manuale minima o nulla. Le tecniche di trasferimento semi-dry consentono una maggiore personalizzazione dei parametri di trasferimento, rendendoli più pratici per un'ampia gamma di pesi molecolari della proteina di interesse. Non è richiesto alcun tampone aggiuntivo.

Bloccare i siti non specifici

Accanto al lavaggio e all'incubazione degli anticorpi, il blocco dei siti non specifici è la fase più critica del western blotting per garantire risultati accurati. Il blocking è fondamentale nella fase di immunorilevamento del western blotting, poiché impedisce il legame non specifico dell'anticorpo alla membrana del blotting.

Dopo il trasferimento delle proteine dal gel, è importante bloccare la superficie rimanente della membrana per prevenire il legame non specifico degli anticorpi. Ciò garantirà che i risultati siano leggibili.

Il blocco viene spesso effettuato con un 5% di albumina di siero bovino (BSA) o latte in polvere scremato diluito in soluzione salina tamponata con Tween 20 (TBST) per ridurre il background e rendere chiari i risultati. A seconda del metodo di rilevamento prescelto, le proteine del latte spesso non sono una soluzione bloccante compatibile. Analizzare questa compatibilità sarà importante per ottenere un western blot ottimale.

Formulazioni dei tamponi di lavaggio

La scelta della migliore soluzione di tampone di lavaggio per il bloccaggio è necessaria per la riuscita del western blot, poiché ci sono vantaggi e svantaggi per le diverse soluzioni. Ciò è determinato da tre fattori: la proteina di interesse, l'anticorpo e il sistema di rilevamento utilizzato.

In teoria, è possibile utilizzare qualsiasi buffer che non abbia un'affinità per legarsi con la proteina bersaglio o con i componenti della sonda. Tuttavia, alcune soluzioni tampone funzioneranno meglio di altre. Ad esempio, se si utilizzano etichette di biotina e anticorpi AP insieme ad anticorpi antifosfoproteina, le soluzioni di blocking con BSA sarebbero la scelta ideale. Poiché il latte contiene caseina (che contiene essa stessa fosfoproteina e biotina), una soluzione bloccante a base di latte interferirebbe con i risultati del test.

Ci sono diversi tamponi di blocking comunemente utilizzati nel western blot:

• Latte scremato in polvere
• Albumina da siero bovino (BSA)
• Siero normalizzato (siero fetale di vitello, coniglio, cavallo o capra)
• Gelatina di pesce
• Caseina purificata
• Polivinilpirrolidone (PVP)
• Buffer commerciali

La soluzione tampone commerciale più comunemente utilizzata è il sodio dodecil solfato (SDS), sebbene il tampone SDS presenti alcune complicazioni quando si lavora con alcune proteine. È stato riportato che proteine come Immobilon-P passano attraverso il piano della membrana in presenza di SDS. Nei casi in cui le proteine abbiano la tendenza a precipitare, il buffer SDS è ottimale.

Quando si esegue un western blot, alcune soluzioni tampone includono una percentuale di metanolo, che può avere sia vantaggi che limitazioni.

Il metanolo aiuta a eliminare l'SDS dalle proteine trasferite con gel di poliacrilammide denaturanti contenenti SDS. Questo stabilizza la geometria del gel durante il processo di trasferimento e può aumentare la capacità di legame delle proteine alla nitrocellulosa (NC) della membrana. Il metanolo aiuta anche nel legame delle proteine alla membrana. Il metanolo non è adatto per trasferire proteine ad alto peso molecolare o se si desidera preservare l'attività enzimatica. Questo perché il metanolo tende a far restringere il gel.

Il trasferimento senza metanolo è ideale anche durante il trasferimento di anticorpi sensibili alla conformazione. Quando si lavora con un tampone a bassa forza ionica senza metanolo, è importante incubare il gel prima del trasferimento per 30-60 minuti. In questo modo si evita il rischio di rigonfiamenti che possono distorcere le bande e rendere i risultati di difficile lettura.

Nella maggior parte dei casi, è buona norma incubare l'anticorpo primario con BSA poiché in genere è necessario in quantità maggiori rispetto all'anticorpo secondario. Ciò consentirà di riutilizzare l'anticorpo se il blot non fornisce un risultato utilizzabile.

Conclusioni

Sebbene il western blot sia una tecnica complessa per il rilevamento delle proteine, Avantor può aiutarti a realizzare il tuo western blot senza intoppi. Avantor ti aiuta a selezionare la migliore tecnologia western blot sul mercato. Semplifichiamo l'approvvigionamento, così puoi concentrarti sul come fornire al tuo team le soluzioni migliori ed innovative per i vostri progetti.