Selezione degli anticorpi per il western blotting e metodi di rilevamento

Anticorpi primari e secondari

I legami dell'anticorpo sono fondamentali nel legame e nel rilevamento delle proteine nel western blotting. Gli anticorpi primari vengono introdotti all'inizio del processo per legarsi alla proteina di interesse. L'anticorpo primario può talvolta essere coniugato con un colorante o un enzima per la fase di rilevamento, tuttavia, se questo non viene aggiunto, è necessario un anticorpo secondario. Gli anticorpi secondari vengono utilizzati per rilevare l'anticorpo primario nel mezzo. I due anticorpi devono essere diretti contro la specie ospite, il che significa che se il primario è monoclonale di topo, il secondario dovrà essere rispettivamente anti-topo. L'uso di un anticorpo secondario invece di un metodo di rilevamento diretto del primario tramite un enzima o un colorante offre l'opportunità di risparmiare tempo e risorse. L'uso di anticorpi primari e secondari consente il processo di stripping dei blot.

Ci sono tre vantaggi principali nello stripping dei blot. Questa tecnica rimuove dalla membrana del blot gli anticorpi primari e secondari che sono stati utilizzati per rilevare una proteina. Lo stripping del blot consente di riesaminare la stessa membrana per consentire il rilevamento di altre proteine sullo stesso campione.

Inoltre, lo stripping del blot può essere utilizzato per effettuare un controllo di caricamento sullo stesso blot. Ciò annulla l'errore o il bias dell'utente durante la rilevazione dei livelli della proteina bersaglio all'interno del campione.

Infine, lo stripping dei blot crea una maggiore efficienza della tecnica western blot, poiché lo stesso campione può essere riutilizzato. La possibilità di riutilizzare i campioni aiuta a ottimizzare la concentrazione degli anticorpi senza sprecare tempo o materiali nell'esecuzione di più corse e trasferimenti di gel.

Ci sono alcune considerazioni da fare quando si imposta un protocollo di stripping. I metodi di stripping richiedono una combinazione di detergente, agente riducente, calore o tamponi a basso pH per indebolire le interazioni antigene-anticorpo. Uno stripping efficace del blot dovrebbe lavare via gli anticorpi, evitando al contempo di interferire con le interazioni proteina-membrana.

La scelta della membrana, del metodo di rilevamento, del metodo di stripping e della sequenza di rilevamento delle proteine deve essere compatibile. Lo stripping ha successo solo quando si utilizzano metodi di rilevamento come l'elettrochemiluminescenza (ECL) o metodi fluorescenti, a differenza dei metodi colorimetrici che lasciano macchie visibili sulla membrana. Si raccomanda di dare la priorità all'uso di anticorpi a bassa affinità per rilevare proteine a bassa abbondanza. Ciò è dovuto al fatto che durante ogni stripping è inevitabile la perdita di una parte di antigene.

Quando si riutilizza un blot, è importante lavare accuratamente la membrana dopo lo stripping prima di riutilizzarla, quindi effettuare nuovamente il blocking per prevenire il legame non specifico degli anticorpi alla membrana.

Metodi di rilevamento

l rilevamento su un western blot è la tecnica che rende possibile la visualizzazione dei risultati. I metodi di rilevamento possono essere costituiti da una reazione enzimatica, o da anticorpi coniugati che possono essere visualizzati direttamente.

Tecnica colorimetrica

Il metodo colorimetrico funziona producendo un precipitato colorato tramite una reazione enzimatica. Questa tecnica è generalmente più facile da usare e non richiede materiali costosi come pellicole radiografiche o uno sviluppatore. Il metodo colorimetrico ha un intervallo di rilevazione in picogrammi inferiore rispetto ad altre tecniche e offre quindi un intervallo di sensibilità di circa 5-500 pg di proteine, con un singolo segnale di uscita.

Chemiluminescenza

La chemiluminescenza è un metodo di rilevamento altamente sensibile, più comunemente utilizzato rispetto ai metodi colorimetrici. La luce viene prodotta come sottoprodotto di una reazione tra un substrato chimico e un enzima. L'intensità della luce viene quindi misurata mediante l'esposizione a una pellicola a raggi X o a un dispositivo ad accoppiamento di carica (CCD) che converte i fotoni in un segnale elettronico.

Esistono due metodi di chemiluminescenza con i rispettivi pro e contro. La chemiluminescenza tramite il rilevamento con pellicola è un metodo altamente sensibile per rilevare le proteine all'interno dell'intervallo del femtogramma. È un metodo più costoso, che richiede la pellicola radiografica, manutenzione dello sviluppatore e una camera oscura. I raggi X/CCD sono in genere più facili da usare ed è più lineare della pellicola, ma spesso richiedono apparecchiature più costose e una formazione approfondita.

Fluorescenza

La fluorescenza è il metodo di rilevamento più utilizzato fino ad oggi nel western blotting. Piuttosto che fare affidamento su una reazione enzimatica per produrre un segnale, gli anticorpi sono coniugati a uno specifico fluoroforo, che può essere analizzato utilizzando un sistema di imaging.

Ciò consente una gamma di linearità molto più ampia rispetto ai precedenti metodi di rilevamento. La fluorescenza consente il sondaggio di più proteine contemporaneamente, con l'uso di vari fluorofori. Ciò può far risparmiare molto tempo ed essere in grado di sondare le proteine che hanno un peso molecolare simile.

Attualmente ci sono diversi sistemi di imaging tra cui scegliere per rilevare i risultati del western blotting in fluoresceza, come luce visibile, LED o laser a infrarossi.

Sistemi di trasferimento di elettroni

Oltre ai metodi di trasferimento in sistemi in serbatoio e semi-dry, esiste un'ampia varietà di metodi di trasferimento da utilizzare all'interno di questi sistemi. Oggi, la metodologia più popolare è l'elettroblotting, o elettrotrasferimento. Questo metodo di trasferimento rapido ed efficace può essere utilizzato su sistemi di trasferimento a umido, semi-dry e dry.

Viene impostato un sistema di trasferimento di elettroni con il gel a diretto contatto con un pezzo di membrana formulato per legare le proteine. Questi due strati vengono quindi posti tra due elettrodi, che vengono immersi in un tampone (sistemi a serbatoio) o racchiusi con carte da filtro saturate di tampone (sistemi a secco e semi-secco).

Durante l'elettroblotting, viene applicato un campo elettrico, che fa sì che le proteine ​​si spostino dal gel alla superficie della membrana, dove si legano al mezzo.

Trasferimento Tank (serbatoio - trasferimento umido)

I trasferimenti a umido sono il metodo tradizionale di trasferimento, che richiede una tempo di trasferimento più lungo di 30-120 minuti. L'uso di un tampone è fondamentale per questa tecnica, che spesso richiede una soluzione contenente metanolo. Ciò richiede protocolli di pulizia più puntuali e lo smaltimento di materiali pericolosi.

Semi-dry

I trasferimenti semi-dry sono significativamente più veloci di un trasferimento standard in serbatoio (Tank), richiedendo circa 7-10 minuti. I tamponi sono ancora necessari, ma non richiedono metanolo per funzionare correttamente. Questa tecnica altamente versatile rende il processo leggermente più semplice, con tempi di fermo e pulizia ridotti. Uno dei maggiori vantaggi del trasferimento semi-dry è che possono essere utilizzati più metodi, creando opportunità per la personalizzazione del protocollo.

Elettroblotting a secco (dry)

Il trasferimento a secco non richiede alcuna soluzione tampone e permette di avere il tempo di trasferimento più veloce, circa 5-7 minuti in totale. Questo metodo utilizza una matrice di gel che incorpora un tampone, anziché serbatoi o carte da filtro imbevute. I sistemi di trasferimento a secco sono incredibilmente facili da usare, con trasferimenti ad alte prestazioni e requisiti minimi di pulizia rispetto agli altri metodi di trasferimento.

Vantaggi e svantaggi del  trasferimento di elettroni

Sensibilità e accuratezza

La tecnica del Western blotting offre la capacità di rilevare proteine con concentrazioni di appena 0,1 nanogrammi all'interno di un campione, rendendolo uno strumento ideale per la diagnostica precoce. Questa maggiore sensibilità riduce anche la necessità di anticorpi, richiedendone meno per i test e riducendo significativamente i costi di laboratorio.

Il Western blot è anche affidabile per il rilevamento delle proteine. Questo perché l'elettroforesi ordina le proteine del campione per dimensione, carica e conformazione. La specificità è supportata anche dall'interazione anticorpo-antigene, che aiuta nel rilevamento di una proteina bersaglio in una miscela complessa. Questo può essere fatto anche con la presenza di oltre 300.000 diverse proteine in uno stesso campione.

Risultati soggettivi e richieste costose

Sebbene il western blot possa fornire risultati precisi, può anche produrre risultati fuorvianti se ci sono errori nella tua tecnica. I falsi positivi possono verificarsi a causa della reazione di un anticorpo con una proteina non prevista, come con le infezioni parassitarie. Considera anche che un falso negativo può verificarsi quando non si da un tempo di trasferimento sufficiente alle proteine ​​più grandi.

Quando le tecniche di blotting sono imprecise, spesso producono bande sbiadite e inclinate che sono soggette all'interpretazione da parte di un tecnico di laboratorio. È importante disporre dei test di controllo e ottimizzare ogni fase del processo di western blot per ottenere risultati chiari e affidabili.

Sono necessari un addestramento adeguato e attrezzature di laboratorio per un blot di successo. La comprensione delle concentrazioni dei reagenti, dei tempi di incubazione e dei protocolli di rilevamento richiede una formazione approfondita e deve essere eseguita da personale di laboratorio qualificato.

Conclusioni

Che tu stia cercando membrane di trasferimento, kit di blotting, reagenti specifici, sistemi di trasferimento o anticorpi esclusivi, Avantor ha le soluzioni per le tue esigenze di laboratorio. Attraverso il nostro sito Web, puoi trovare diversi servizi e risorse per aiutarti lungo il percorso.