Strumenti per analisi HPLC
Quando i ricercatori fanno scoperte scientifiche utilizzando la chimica analitica, è importante disporre dello strumento giusto per ottenere risultati affidabili. Le analisi HPLC richiedono apparecchiature specializzate compatibili con l’analita. Per decidere quale apparecchiatura chimica è necessaria per il tuo laboratorio di analisi, devi innanzitutto confermare la tua metodologia in base alla composizione del materiale del campione. Le tecniche HPLC possono essere perfezionate per soddisfare le tue esigenze specifiche e con una conoscenza approfondita della cromatografia puoi sviluppare un flusso di lavoro affidabile.
La cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) è una tecnica analitica utile per composti chimici come piccole molecole e biopolimeri. Questa tecnica prevede lo studio di un campione disciolto in una soluzione, che viene poi iniettata in una colonna contenente una resina che interagisce con il campione. Questa interazione rallenta il movimento del campione attraverso la colonna, dove viene poi rilevato. I dati vengono ricavati dalla tempistica del movimento del campione e dall’intensità del rilevamento del campione.
Per saperne di più sull'utilizzo dell'HPLC, visita la nostra pagina dedicata alle soluzioni cromatografiche. Avantor offre un’ampia selezione di risorse e prodotti per soddisfare le tue esigenze.
Cromatografia liquida ad alte prestazioni
In poche parole, la cromatografia liquida ad alte prestazioni si basa sul principio che i singoli composti si comportano in modo diverso in acqua. L’HPLC separa e purifica i composti in base alla loro polarità, ovvero alle loro proprietà idrofobe/idrofile.
Esistono due tipi di cromatografia: a fase normale e a fase inversa. Le diverse composizioni di resina nella colonna determinano il tipo di cromatografia da eseguire e le molecole che possono essere separate.
Fase normale
In questo metodo, la colonna è riempita con particelle di silice polari e un tampone non polare. Una volta iniettato il campione, le particelle polari si attaccano alla silice, mostrando un tempo di ritenzione più lungo rispetto alle molecole non polari.
Fase inversa
Quando si esegue la cromatografia in fase inversa, la colonna viene riempita di particelle idrofobiche con un tampone polare. Le molecole idrofobiche si attaccano più a lungo alla resina e possono essere rilevate più facilmente.
Utilizzo di sostanze chimiche per la preparazione dei campioni di laboratorio
I processi principali di preparazione di un campione per il test HPLC sono tre: diluizione, centrifugazione e filtrazione. Ogni fase richiede diverse sostanze chimiche che, se pianificate correttamente, possono ridurre al minimo le spese e ottimizzare il protocollo. È essenziale selezionare le sostanze chimiche corrette per la preparazione dei campioni, in quanto possono aiutare a risparmiare tempo, denaro e risorse nel tuo laboratorio.
Diluizione
La chiave per una corretta diluizione di un campione è determinare quali sostanze chimiche funzionano meglio per il metabolita a cui si è interessati. Un solvente può favorire una classe chimica, mentre ne perde o diminuisce un’altra. L’acqua e altri solventi sono comunemente scelti per questo motivo. Per esempio, i solventi organici come il metanolo o l’acetonitrile vengono utilizzati per frantumare le proteine ed estrarre contemporaneamente le piccole molecole.
Centrifugazione
Questa fase può aiutare a preservare lo strumento per le analisi e a proteggere la qualità del campione durante la filtrazione. La centrifugazione fa cadere le particelle in sospensione sul fondo della provetta del campione, con un vigoroso movimento di agitazione per mescolare la soluzione.
Si consiglia di miscelare un campione per 5 minuti alla massima velocità utilizzando una centrifuga da banco. In questo modo si riducono gli sprechi nel recupero dei campioni filtrati e si riduce l’uso di costosi materiali di filtrazione che spesso richiedono tempi di filtrazione più lunghi. Sebbene la centrifugazione non richieda ulteriori sostanze chimiche, riduce significativamente la quantità necessaria in altre fasi.
Filtrazione
Un laboratorio analitico può trattare centinaia di campioni alla settimana, richiedendo risultati rapidi e accurati. Questo equilibrio tra velocità e qualità è profondamente influenzato dalle tecniche di filtrazione.
La filtrazione è importante per una corretta preparazione dei campioni HPLC per due motivi principali: proteggere la pompa dal particolato presente nel solvente e impedire che le particelle intasino e danneggino la colonna HPLC.
L’uso di solventi premiscelati e filtrati può ridurre al minimo il potenziale di contaminazione attraverso il solvente. Questo livello di purezza contribuisce a ridurre la manutenzione dell’apparecchiatura. L’aggiunta di una fase di filtrazione prima del caricamento del campione nella colonna o nel punto di raccolta può ridurre gli errori dovuti alla contaminazione e proteggere le apparecchiature dall’usura a lungo termine.
Selezione delle sostanze chimiche per la preparazione dei campioni HPLC
Quando si stabilisce una tecnica efficiente per la preparazione dei campioni HPLC, è fondamentale procurarsi sostanze chimiche che siano purificati e che abbiano le reazioni necessarie con i composti target.
Nella preparazione dei campioni si utilizzano spesso solventi come acetonitrile, metanolo e acqua per la filtrazione. Alcuni dei migliori solventi per l’analisi HPLC sono sottoposti a controlli di qualità per la trasparenza UV, per favorire una sensibilità ottimale, e sono privi di impurità metalliche che spesso influiscono sull'attività biologica del campione.
La disponibilità di sostanze chimiche di filtrazione adeguate migliora la velocità delle analisi e spesso elimina le apparecchiature e le risorse aggiuntive utilizzate per filtrare ulteriormente un campione che potrebbe essere soggetto a contaminazione.
Selezione dei solventi per evitare la contaminazione
La scelta delle giuste soluzioni chimiche può essere fondamentale per evitare che il campione HPLC contenga contaminanti che possono alterare i risultati dei test e danneggiare le apparecchiature. Gli estraibili sono composti rilasciati da un componente, come una membrana filtrante, che è a contatto con il solvente del campione. La quantità di estraibili varia a seconda della resistenza al solvente del componente, nonché delle temperature e delle pressioni coinvolte.
Gli estraibili possono influire sull’accuratezza dell’HPLC interferendo con l’analisi se sono rilevabili dal metodo analitico a valle. Questi composti introducono rumore nei dati, riducendo la qualità complessiva dei dati. Questo può essere particolarmente problematico quando l’analita target ha lo stesso tempo di ritenzione dell’estraibile.
Confermare che la membrana di filtrazione abbia un’elevata compatibilità chimica con i solventi della fase mobile può ridurre significativamente le sostanze estraibili.
Le membrane in politetrafluoroetilene (PTFE), polivinilidene difluoruro (PVDF) e cellulosa rigenerativa (RC) sono scelte popolari, in quanto altamente compatibili con i comuni solventi della fase mobile. L’acqua purificata, l’acetonitrile e il metanolo sono tutti solventi popolari.
Un altro modo per prevenire la contaminazione è quello di ridurre la variazione dei materiali all’interno del laboratorio. La standardizzazione di due tipi di membrane e il loro utilizzo in vari formati favorisce la coerenza in laboratorio.
Potresti usare gli stessi materiali di membrana in circoli di membrane per la filtrazione a fase mobile, filtri a siringa per la preparazione manuale e filtri senza siringa per la filtrazione automatizzata. In questo modo si ridurrà il numero di materiali di consumo da tenere a magazzino, riducendo al minimo le esigenze di spazio e il fastidio di rifornire una lista di materiali diversi.
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Conclusioni
L’approvvigionamento di apparecchiature chimiche HPLC per la lavorazione su larga scala o per la ricerca all’avanguardia dovrebbe essere semplice. Avantor® fornisce prodotti di alta qualità e strumenti di risorse per il successo del tuo laboratorio.
La corretta movimentazione delle sostanze chimiche di laboratorio per HPLC è un’altra considerazione importante per l’approvvigionamento delle apparecchiature e il mantenimento del controllo di qualità. Per ulteriori informazioni sulla movimentazione delle comuni sostanze chimiche di laboratorio, visita la nostra pagina sui prodotti chimici di laboratorio e i loro usi.
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