Soluzioni di citometria

La citometria a flusso è una tecnologia basata sul laser utilizzata per rilevare e misurare le caratteristiche fisiche e chimiche di cellule o particelle che scorrono in una sospensione fluida attraverso un fascio luminoso. 

La citometria a flusso è una tecnica efficiente e ampiamente utilizzata per identificare e caratterizzare diverse cellule immunitarie in campioni eterogenei. Si basa principalmente sull'uso di molecole marcate con fluorescenza per identificare e caratterizzare i profili di antigeni in una varietà di applicazioni di ricerca e per la diagnostica clinica su base monocellulare.

Utilizzando diversi fluorocromi con lunghezze d'onda di emissione che coprono l'intero spettro cromatico, è possibile rilevare simultaneamente proteine associate a compartimenti di superficie, citosolici e nucleari.

La citometria a flusso è una tecnica incredibilmente versatile e negli ultimi anni ne sono state sviluppate molte varianti. Il sorting cellulare mediato dalla fluorescenza (FACS) è un derivato della citometria a flusso che aggiunge un livello maggiore di funzionalità. Nella pratica, i termini “citometria a flusso” e “FACS” sono spesso utilizzati in modo intercambiabile.

La citometria a flusso si è dimostrata uno strumento analitico prezioso nel campo della diagnosi delle malattie. È possibile analizzare un gran numero di cellule in pochi minuti, con numerosi vantaggi  rispetto ad altri metodi di analisi come la visione “Cellometer” o la microscopia.

Applicazioni di citometria per le analisi

In un citometro a flusso:

• le cellule campione vengono fatte passare una alla volta attraverso uno stretto canale.
• La luce viene utilizzata per illuminare le cellule nel canale.
• Una serie di sensori rileva i tipi di luce rifratta o emessa dalle cellule.
• I dati acquisiti dai sensori vengono compilati e integrati per avere un quadro completo del campione.

La citometria a flusso utilizza marcatori fluorescenti per identificare e analizzare i componenti delle cellule. Il DNA, l'RNA, le proteine o altre molecole presenti nella cellula vengono marcati con coloranti fluorescenti. Se poi gli impulsi laser vengono “sparati” sulla cellula, le molecole marcate vengono illuminate brevemente. 

La luce emessa in ciascuna cellula può essere rilevata dal citometro a flusso e la quantità relativa di ciascun componente può essere misurata in base alla sua intensità. Si tratta di una procedura cruciale per la diagnosi e la prognosi della malattia.

L'analisi dei dati della citometria a flusso si basa sul principio del gating. I gate e le regioni sono posizionate intorno a popolazioni di cellule con caratteristiche comuni, di solito dispersione in avanti, dispersione laterale ed espressione dei marcatori, per studiare e quantificare le popolazioni di interesse. 

Il gating consente al ricercatore di raccogliere e visualizzare più informazioni su una sottopopolazione di cellule rispetto a quelle normalmente visualizzabili su un dot-plot a 2 o 3 dimensioni.

Un citometro a flusso è composto da tre sistemi principali: fluidico, ottico ed elettronico. 

• Il sistema fluidico trasporta le particelle in un flusso verso il raggio laser per l'interrogazione.
• Il sistema ottico è costituito da laser per illuminare le particelle nel flusso del campione e da filtri ottici per dirigere i segnali luminosi risultanti ai rivelatori appropriati.
• Il sistema elettronico converte i segnali luminosi rilevati in segnali elettronici che possono essere elaborati dal computer. Per alcuni strumenti dotati di una funzione di selezione, il sistema elettronico è anche in grado di avviare decisioni di selezione per caricare e deviare le particelle.

Una macchina per la citometria a flusso viene utilizzata per eseguire i seguenti compiti, importanti per la diagnosi delle malattie:

• conteggio delle cellule ematiche
• Osservazione dei diversi tipi di leucociti presenti in un campione
• Smistamento delle cellule T per determinare come la loro funzione sia stata influenzata da un'infezione
• Determinazione del contenuto totale di DNA nelle cellule durante l'esecuzione di biopsie tumorali nella ricerca sul cancro
• Studio dell'effetto delle malattie infettive sulle singole cellule con lo smistamento delle cellule
• Rilevamento di microbi patogeni in campioni biologici e ambientali
• Rilevamento delle cellule della malattia minima residua nei fluidi corporei

Nonostante la citometria a flusso sia ben consolidata come tecnica di biologia cellulare, lo sviluppo della citometria a flusso ad alto rendimento (HTFC), consentito dall'introduzione di un più rapido campionamento su piastra, ha trasformato questa tecnologia in un'interessante piattaforma per la scoperta di farmaci.

Alcune delle principali applicazioni della citometria a flusso (nell'ambito dei moderni contesti clinici) comprendono: 

• espressione di proteine, in tutta la cellula, anche nel nucleo
• Modificazioni post-traslazionali delle proteine, comprende le proteine scisse e fosforilate
• RNA, compresi i transcript di miRNA e mRNA
• Stato di salute delle cellule, rilevamento di cellule apoptotiche o morte cellulare
• Stato del ciclo cellulare, fornisce un potente strumento per valutare le cellule in fase G0/G1 rispetto alla fase S, G2 o alla poliploidia, compresa l'analisi della proliferazione e dell'attivazione cellulare
• Identificazione e caratterizzazione di sottoinsiemi distinti di cellule all'interno di un campione eterogeneo, compresa la distinzione delle cellule della memoria effettrice centrale dalle cellule T esaurite o dalle cellule T regolatorie

Selezione delle cellule

Rispetto ad altre tecniche di isolamento come la separazione con microsfere magnetiche e il panning, la citometria a flusso offre questi vantaggi:

• elevata purezza 
• Può separare i tipi di cellule in base al loro livello di intensità di fluorescenza
• Migliore separazione delle popolazioni utilizzando più anticorpi
• Maggiore recupero di cellule di interesse
• Può eliminare le cellule morte
• Può smistare in base alla colorazione interna (DNA, espressione di citochine, GFP, ecc.)
• Può smistare fino a quattro popolazioni contemporaneamente

Gli svantaggi o le limitazioni della citometria a flusso includono:

• il laser può analizzare solo una cellula alla volta 
• Le cellule devono essere in sospensione per essere analizzate (limitando così l'analisi dei tessuti) 
• Sono necessari operatori altamente qualificati
• Le cellule devono essere vitali per poter essere analizzate

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La citometria a flusso si è evoluta da una nuova e promettente tecnologia a uno strumento diagnostico scientifico indispensabile, e la frontiera delle sue applicazioni continua a espandersi. 

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