Preparazione dei campioni di proteine per la spettrometria di massa

Preparazione dei campioni di proteine

Per eseguire un'analisi di spettrometria di massa di successo, è necessario preparare correttamente il campione. Ciò comprende una serie di fasi che possono essere specifiche a seconda della natura del campione.

In genere, un campione viene sottoposto a un processo di più fasi che comprende la purificazione, la digestione, la deplezione e l'arricchimento. Alcune di queste fasi possono avvenire più di una volta, a seconda del tipo di cellula e dell'abbondanza della proteina bersaglio, nonché della composizione del campione.

Preparazione dei campioni di proteine per la spettrometria di massa

Ci sono diversi fattori da considerare quando si prepara un campione di proteine per la spettrometria di massa. La progettazione di una strategia di preparazione del campione deve tenere conto di quanto segue: origine e proprietà fisiche del campione, abbondanza delle proteine bersaglio, nonché complessità e localizzazione cellulare delle proteine. La comprensione di questi elementi del campione restringe le opzioni per le procedure di spettrometria di massa. Quando si lavora con campioni complessi, può essere necessario utilizzare tecniche specializzate per selezionare le proteine bersaglio. Ciò può richiedere flussi di lavoro che incorporino:

  • Lisi cellulare ottimizzata
  • Frazionamento subcellulare
  • Deplezione delle proteine abbondanti
  • Arricchimento di proteine selezionate
  • Strumenti di etichettatura di massa

Ciascuna di queste fasi può svolgere un ruolo chiave nella produzione di risultati accurati nella rilevazione o nell'isolamento delle proteine.

Preparazione del lisato

La lisi fisica è una tecnica utilizzata per disgregare le cellule ed estrarre il contenuto cellulare. Richiede attrezzature e protocolli specializzati, poiché spesso esiste una notevole variabilità nell'apparecchiatura. Ciò può essere dovuto a differenze nelle impostazioni di sonicazione o addirittura a pestelli diversi.

La lisi cellulare interrompe i compartimenti cellulari, attivando le proteasi e le fosfatasi endogene. Per questo motivo è importante proteggere le proteine estratte dalla degradazione causata dalle attività di questi enzimi. Ciò può essere fatto aggiungendo un inibitore di proteasi e/o fosfatasi ai reagenti di lisi.

L'esecuzione della lisi cellulare presenta alcune limitazioni che possono richiedere alternative o ulteriori tecniche di trattamento. La lisi non è in genere adatta a piccoli volumi di campione o alla manipolazione di campioni ad alta produttività. I metodi di lisi fisica da soli non solubilizzano le proteine associate alla membrana.

Tuttavia, i metodi di lisi basati su reagenti possono lisciviare le cellule, solubilizzando al contempo le proteine. Utilizzando diversi tamponi, detergenti, sali e agenti riducenti, la lisi cellulare può essere ottimizzata in base al tipo di cellula o alla frazione proteica richiesta.

Per mantenere l'integrità della proteina target, può essere necessario aggiungere e successivamente rimuovere alcuni detergenti per studiare correttamente le proteine. In questo modo si mantiene la stabilità a lungo termine delle proteine estratte.

Deplezione e arricchimento

L'obiettivo delle strategie di deplezione e arricchimento è quello di rimuovere le proteine più abbondanti o di isolare le proteine target presenti nel campione.

La deplezione è spesso utilizzata per ridurre la complessità di un campione biologico (come il sangue o il siero, che contengono alte concentrazioni di albumina e immunoglobuline). Per eseguire la deplezione su un campione sono disponibili tecniche di immunoaffinità come l'immunoprecipitazione, la co-immunoprecipitazione e kit commerciali. L'unico inconveniente significativo di questa tecnica è che le proteine abbondanti spesso si legano ad altre proteine, causando la deplezione dei complessi con le proteine a bassa abbondanza.

L'arricchimento delle proteine isola sottoclassi di proteine cellulari. Ciò può essere ottenuto utilizzando una serie di tecniche che identificano: attività biochimica unica, modifiche post-traslazionali (PTM) o localizzazione spaziale all'interno della cellula. Le proteine possono anche essere arricchite utilizzando composti specifici per le classi enzimatiche o reagenti di etichettatura impermeabili alle cellule che etichettano selettivamente le proteine della superficie cellulare.

La separazione di frazioni subcellulari distinte può essere utilizzata come metodo di arricchimento. Ciò può essere ottenuto mediante tecniche di disgregazione fisica, soluzioni detergenti e tampone, e metodi a gradiente di densità. Questo tipo di separazione è ideale quando si cerca di separare una proteina di membrana idrofobica da una proteina idrofila.

Infine, la centrifugazione a gradiente di densità è un'altra tecnica ideale per isolare nuclei intatti, mitocondri e altri organelli prima della solubilizzazione delle proteine.

Dialisi e desalinizzazione

Per garantire che un campione sia compatibile e ottimizzato per la digestione e l'analisi mediante spettrometria di massa, possono essere necessarie ulteriori fasi come la dialisi e la desalinizzazione.

La spettrometria di massa misura gli ioni carichi, pertanto i sali devono essere rimossi prima della MS per ridurne al minimo la rilevazione (in particolare i sali di sodio e fosfato). La dialisi e la desalinizzazione consentono lo scambio di tamponi e la rimozione di piccole molecole per evitare interferenze con i processi a valle.

Denaturazione e digestione delle proteine

La digestione può essere eseguita sia in soluzione che mediante elettroforesi su gel a 1 o 2 dimensioni. La scelta di una tecnica rispetto all'altra dipende da due fattori principali: la quantità e la complessità del campione.

Quando si esegue la digestione in soluzione, le proteine vengono denaturate con forti agenti caotropici, seguiti da un agente riducente. Queste proteine denaturate e ridotte vengono poi alchilate per impedire in modo irreversibile la riformazione dei legami disolfuro. Le proteine alchilate vengono poi digerite dalle endoproteinasi, che rompono idroliticamente i legami peptidici per frammentare le proteine in peptidi.

La digestione in soluzione è ideale quando si lavora con un campione di piccole dimensioni, poiché l'estrazione dei peptidi dalla digestione in gel può comportare una perdita significativa di peptidi. La digestione in soluzione è anche la migliore per i campioni di complessità da bassa a moderata, dove i detergenti avrebbero un impatto negativo sul campione. Per quanto riguarda la durata e l'automazione, è preferibile la digestione in soluzione. Non solo viene eseguita più rapidamente, ma è anche comunemente automatizzata.

La separazione delle proteine mediante elettroforesi su gel impiega l'elettroforesi su gel di poliacrilammide SDS per denaturare e separare le proteine di un campione. Dopo l'elettroforesi, le bande proteiche vengono visualizzate e poi estratte dal gel. I tappi di gel possono quindi essere ridotti, alchilati e digeriti. I peptidi vengono poi estratti dalla matrice del gel e possono essere preparati per l'analisi MS.

Un vantaggio della digestione in gel è che combina la denaturazione delle proteine con la loro separazione, indicando visivamente l'abbondanza relativa delle proteine nel campione. L'estrazione dei peptidi rimuove anche gran parte dei detergenti e dei sali, anche se ciò può influire sul recupero dei peptidi.

Arricchimento dei peptidi

Nella fase finale della preparazione del campione per la spettrometria di massa, viene eseguito l'arricchimento dei peptidi bersaglio. Questa fase, insieme alla pulizia del campione, è necessaria per l'analisi di proteine a bassa abbondanza o per l'identificazione di peptidi post-traslazionali modificati.

L'arricchimento viene eseguito mediante purificazione per affinità utilizzando anticorpi o ligandi specifici, che si legano selettivamente ai composti bersaglio.

Dopo l'arricchimento dei peptidi, i sali e i tamponi possono essere rimossi utilizzando colonne di affinità o reagenti detergenti-precipitanti. I concentratori possono essere utilizzati anche per i campioni diluiti, che sono disponibili in una varietà di intervalli di cutoff del peso molecolare (MWCO).

A questo punto, il campione di peptidi purificato è pronto per la preparazione finale per l'analisi MS. Se si effettua un'analisi LC-MS o LC-MS/MS, la scelta corretta delle fasi mobili e dei reagenti per l'accoppiamento degli ioni è fondamentale per ottenere una buona risoluzione LC e risultati analitici di qualità.

I motivi per cui l'analisi delle proteine va male

Ci sono diversi fattori che possono portare la preparazione del campione fuori strada, causando un'analisi impropria con lo spettrometro di massa. Uno degli ostacoli più comuni in cui ci si imbatte con la spettrometria di massa sono le complicazioni legate all'impossibilità di identificare gli aminoacidi. Ecco gli errori più comuni alla base di questo errore:

  • Digestione impropria delle proteine
  • Il peptide idrofilo/di piccola natura passa attraverso la colonna del back stage con il sale e non può essere analizzato
  • Scarsa frammentazione: i peptidi sono idrofobici o troppo grandi e non possono essere rimossi dalla colonna o sono troppo grandi per essere analizzati tramite MS
  • Le modalità di frammentazione dei peptidi non possono essere analizzate. Diversi spettri sono inspiegabili nell'indagine

Cose da evitare quando si prepara un campione di proteine

Ionizzazione e concentrazione del campione

Le tecniche di ionizzazione utilizzate per le molecole di grandi dimensioni spesso funzionano bene quando la miscela di campioni contiene quantità uguali di costituenti. Quando questa è sbilanciata, si possono verificare dei problemi. Per i campioni con un'elevata gamma di abbondanza proteica, le proteine più abbondanti tendono a sopprimere i segnali di quelle meno abbondanti.

Semplificare il campione

L'analisi dello spettro di massa di una miscela complessa è già una sfida a causa dell'elevato numero di componenti. Ciò può essere ulteriormente aggravato dalla digestione enzimatica di un campione proteico in un gran numero di prodotti peptidici. Il successo dell'analisi dipende da un campione pulito e di complessità limitata. È importante ridurre al minimo qualsiasi complessità che possa causare la soppressione della ionizzazione o il sottocampionamento dei peptidi eluiti.

Campioni complessi e arricchimento

Una sfida della spettrometria di massa è che può essere difficile rilevare le proteine in tracce quando sono presenti in concentrazioni molto più basse rispetto ad altri prodotti biologici. Questo problema può essere combattuto sovraccaricando la colonna, ma a spese della soppressione della ionizzazione e della saturazione del rilevatore MS. Arricchire i campioni impoverendo le proteine del prodotto è un obiettivo a lungo termine, che ha dimostrato un certo successo.

Pro e contro della spettrometria di massa

La spettrometria di massa presenta notevoli vantaggi come tecnica analitica:

  • maggiore sensibilità rispetto alla maggior parte delle altre tecniche analitiche
  • Un filtro di carica di massa riduce l'interferenza di fondo
  • Eccellente specificità, grazie all'utilizzo di pattern di frammentazione per l'identificazione di sostanze sconosciute o la conferma della presenza di composti
  • Informazioni sul peso molecolare. Identificazione di composti sconosciuti
  • Dati sull'abbondanza isotopica degli elementi

Tuttavia, presenta una serie di svantaggi:

  • Non distingue tra isomeri ottici e geometrici 
  • Non riesce a distinguere tra le posizioni dei sostituenti (in posizione o-, m- e p-)
  • Limitazioni nell'identificazione di idrocarburi che producono ioni frammentati simili

Anche con i rischi e le limitazioni di cui sopra, la sfida più grande della spettrometria di massa è rappresentata dalle variazioni del tipo di campione in cui ci si imbatte. Ogni campione avrà una composizione unica e potrà anche essere ricevuto a vari livelli di processo di preparazione del campione.

Capire come lavorare attraverso questi parametri per produrre campioni compatibili con lo spettrometro di massa è fondamentale per il tuo successo. Ciò richiede flessibilità, creatività e la comprensione delle numerose opzioni di preparazione dei campioni. Per ulteriori informazioni sui test analitici, visita il sito Avantor per conoscere gli ultimi sviluppi nel campo della cromatografia e della spettrometria di massa.