RMN

La Risonanza Magnetica Nucleare (RMN) è una tecnica spettroscopica che può essere utilizzata per ottenere proprietà strutturali e dinamiche delle molecole sfruttando il comportamento di alcuni atomi quando inseriti in potentissimi magneti super-conduttori (da 180 000 a 360 000 più potenti rispetto al campo magnetico terrestre per magneti UConn Health). Quando i nuclei RMN-active vengono inseriti in un potente campo magnetico, i loro nuclei si allineano con il campo e iniziano a processare ad una frequenza che dipende dalla percentuale giromagnetica degli isotopi e dalla potenza del campo magnetico applicato, insieme all'ambiente chimico e fisico dell’atomo. Il componente della frequenza che dipende dall’ambiente chimico e fisico è noto come spostamento chimico. Gli esperimenti di RMN consistono nel perturbare l'allineamento applicando brevi impulsi di energia di radiofrequenza (RF), al fine di determinare lo spostamento chimico di ciascuno degli atomi attivi RMN nella molecola in esame. Utilizzando la combinazione di impulsi e ritardi (nota come sequenza di impulsi), è possibile ottenere ulteriori informazioni, come per esempio quali atomi sono legati tra di loro e quali atomi sono spazialmente vicini l'uno all'altro. Mediante diversi tipi di esperimenti è possibile determinare la struttura tridimensionale delle molecole, comprese le grandi bio-molecole come le proteine.

Le ricerche con la RMN ad alta risoluzione sono più indicate per le proteine con una massa inferiore di appros. 25 kDa e solubili a circa 0,5 mM. In determinati casi è possibile analizzare proteine o complessi di grandi dimensioni o solubilità più bassa. Le proteine delle membrane sono difficili da studiare utilizzando metodi ad alta risoluzione, ma stanno emergendo nuove tecniche che potrebbero essere applicate. Poiché di solito gli studi RMN richiedono l’etichettatura, devono essere disponibili le proteine con isotopi stabili 15N, 13C e alcune volte 2H (sistema di espressione adatto alla crescita in terreni etichettati). Le proteine devono essere purificate (di solito è necessario un valore >95%), incrociate e almeno marginalmente stabili. Si raccomanda di eseguire prima la caratterizzazione per dicromia circolare e denaturazione termica o solvente.

È difficile rispondere, perché dipende dalla domanda posta e dal comportamento del campione. Di solito servono da 300 µl (con per provette per RMN) a 600 µl di campione. Le concentrazioni di proteine per i sistemi con un buon comportamento, dovrebbero essere superiori a 150 µM per gli studi strutturali, e per altri studi non strutturali invece, è possibile utilizzare concentrazioni più basse. Poiché 150 µM è una stima approssimativa per la concentrazione più bassa da utilizzare per gli studi strutturali, si raccomandano concentrazioni di proteine più alte possibili, le quali dovrebbero essere limitate dalla solubilità e dal comportamento della proteina piuttosto che dalla quantità della proteina preparata. La quantità di tempo impiegata per eseguire esperimenti più lunghi per compensare le basse concentrazioni, e tutto il tempo che serve per interpretare lo spettro RMN, saranno certamente più lunghi rispetto a quello necessario per preparare un campione supplementare.

Una volta che il campione è stato sufficientemente purificato ed essiccato, il passo successivo è scegliere il solvente adatto. Da quando il deuterio è diventato di gran lunga il nucleo di bloccaggio più popolare, il campione viene dissolto in un solvente deuterato (si tratta di un solvente i cui atomi di idrogeno (di solito oltre il 99%) vengono sostituti con deuterio). I solventi deuterati più comunemente utilizzati sono l’acetone-d6, il benzene-d6 e il cloroformio-d, nonostante ne siano disponibili molti altri.

Fattori da considerare quando si sceglie un solvente:

1. Solubilità:

• tanto più solubile il solvente, quanto è migliore. Ciò massimizza la quantità di campione entro il volume sensibile, il che aumenta la sensibilità dell'esperimento. Un’elevata solubilità è piuttosto importante quando sono disponibili piccole quantità di campione.

2. Interferenza tra i segnali del solvente e lo spettro del campione

• Il solvente stesso produce inevitabilmente segnali RMN, il che oscura le regioni dello spettro. Questi ‘picchi di solvente residuo’ non dovrebbero sovrapporsi con i segnali provenienti dal campione.

3. Dipendenza dalla temperatura:

• per gli esperimenti che si eseguono al di sopra o al di sotto della temperatura ambiente, anche i punti di fusione o di bollitura dei solventi sono fattori importanti. Inoltre, la solubilità del campione varia con la temperatura.

4. Viscosità:

• tanto più bassa la viscosità del solvente, quanto migliore la risoluzione dell'esperimento.

5. Costi:

• per le RMN di routine, laddove è necessario misurare molti campioni, anche i costi per il solvente sono un fattore importante. Come regola generale, il prezzo aumenta con il numero di atomi deuterati.

6. Contenuto d’acqua:

• quasi tutti i solventi per RMN contengono tracce d’acqua. Molti di questi sono igroscopici (cioè, assorbono acqua dall'atmosfera) e tanto più a lungo vengono conservati quanta più acqua conterranno. La presenza di un picco d’acqua (HDO) servirà solo a degradare la qualità dello spettro RMN. Il livello dell’acqua nel solvente può essere ridotto di molto, filtrandolo attraverso un agente di essiccazione o conservandolo su setacci molecolari.
• La scelta del solvente per un particolare campione dipenderà dal miglior compromesso tra i diversi vantaggi e svantaggi di ciascuno. Per maggiori dettagli su specifici solventi, fai riferimento al testo RMN standard.